【后天或者元旦完结】
?有很多研究发发现昼夜节律相关因子的失调与 NSCLC 的复发和转移有关，因此识别出昼夜节律相关因子也是目前临床所需要的。该研究发现，HLF在早期复发的 NSCLC 组织中显著降低，与 NSCLC 患者的早期进展与远处转移显著相关。并且上调 HLF 可抑制肺定植，而沉默 HLF可促进体内 NSCLC 细胞向骨、肝和脑的转移。
?机制：下调 HLF 促进非锚定的 NSCLC 细胞在低营养条件下的无氧代谢，通过PPARα和PPARγ转运、激活NF-κB/p65信号通路，基因的缺失和甲基化均有助于下调 NSCLC 组织中的 HLF 的表达。HLF有可能成为临床干预 NSCLC 的新靶点。
?虽然多种治疗策略对原发性非小细胞肺癌的治疗具有良好的前景，但由于其早期复发和广泛的转移潜力，非小细胞肺癌仍然是癌症相关死亡的主要原因。
?从名字上说，昼夜节律相关分子由一系列的时钟基因和蛋白质组成，在睡眠周期的调节中发挥着重要作用。越来越多的研究报道，昼夜节律相关调节因子的失调通过不同的机制与肿瘤的发生和转移有关。近年来，生物钟基因在 NSCLC 中的作用得到了广泛的关注。例如，在肺腺癌中，过表达CRY2、BMAL1 和 RORA 联合下调 TIMELESS 和 NPAS2 的表达与预后良好相关，而DEC1和 TIMELESS 高表达预示着在鳞状细胞NSCLC中较差的总生存率。
?通过分析来自癌症基因组图谱(TCGA)的 NSCLC 数据集中的多个昼夜相关调控因子和我们之前来自Array表达(AE-meta)的整合 RNA 表达谱，在目前的研究中，我们辨认出了一个昼夜基因——肝白血病因子(HLF)，它是脯氨酸和富含酸性氨基酸的碱性亮氨酸拉链转录因子家族(PARbZIP)的成员，在早期复发的NSCLC组织中显著减少，这与 NSCLC 患者的早期进展和远处转移显著相关。
?来自 TCGA 的 NSCLC RNA测序数据集，我们发现与相邻正常组织(ANT)相比，NSCLC 组织中 HLF 的表达水平显著降低。通过分析来自 TCGA 的 NSCLC 数据集，与非复发的 NSCLC 组织3年内未复发，n=72）相比，HLF 也是早期复发的 NSCLC 组织（一年内复发，n=72）中所有昼夜节律相关调节下调因子之一。
?我们之前基于 AffymetrixU133 Plus2.0芯片(AE-meta)结合TCGA分析的 NSCLC 整合数据谱的结果进一步表明，NSCLC 组织中 HLF 的表达显著下调，并且在早期复发的 NSCLC 组织中进一步减少（补充图A，B）。
图片? Real-time PCR 和 Western 印迹分析显示，与匹配的ANT相比，7/10对 NSCLC 组织中 HLF 的 mRNA 和蛋白水平降低(图1C和D）。
? Western blot 分析配对 NSCLC 组织中 HLF 蛋白水平与配对 ANT 的比较。α-微管蛋白作为负载控制。
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? 1年复发 NSCLC 组织(n = 5)与3年非复发 NSCLC 组织(n =5)的HLF mRNA 表达和蛋白水平。转录水平归一化为 GAPDH 表达， P<0.05。
?此外，与非复发 NSCLC 组织相比，早期复发 NSCLC 组织中 HLF 表达显著下调（图1E，F）。
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?不同亚型 NSCLC 及良性肺疾病组织中 HLF 免疫组化染色的典型图片（图A）。恶性NSCLC组织和良性肺组织中 HLF 不同免疫组化染色指数的病例数(良性肺组织，n=64;ADC， n= 204;SQC， n=112;非小细胞肺癌其他亚型，n=26)（图B）。与TCGA(ANT)(ANT、=109、ADC、=511、SQC、=502)相比，ADC 和 SQC 中 HLF 表达下调（图C）。来自TCGA和AE-meta的 NSCLC 数据集证明了这一点（D，E）
? Kaplan-Meier生存分析进一步显示，与高 HLF 表达的 NSCLC 患者相比，低 HLF 表达的NSCLC 患者的无进展生存期更差(图2F)，这与TCGA、AE-meta 和 K-MPlotter 分析结果一致(图2G-I)。
?同样，在低 HLF 表达的 ADC 和 SQC 患者中观察到较短的无进展生存期(图2J-Q)。
以上结果说明，低表达HLF与NSCLC的晚期临床病理特征和早期进展相关。
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?此外，HLF 的表达水平随着临床分级和阶段（补充图1G–I）的提高而逐渐下降(补充图1E，F）。
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?我们首先将 NSCLC 患者分为I级至III级和I级至IV级的不同亚组，如补充图2A-F所示，在相同病理分级下，低表达 HLF 的 NSCLC 患者的无进展生存期较高表达 HLF 的患者短。相应的，根据多个独立数据集，包括我们的样本(补充图2G和H)，TCGA（补充图2I和J），AE-Meta(补充图2K和L)和K-M Plotter(补充图2M?O)，在相同临床阶段的 NSCLC 患者中也有类似的发现。
?综上所述，我们的研究结果表明，低表达 HLF 与 NSCLC 患者的早期进展和晚期临床病理特征显著正相关。
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?进一步研究发现，在 NSCLC 患者中，HLF 下调与较短的局部无复发生存期和远处无转移生存期呈正相关(补充图3A-D)。同样，低表达 HLF 的 ADC 患者以及 SQC 患者(补充图3I-L)的局部无复发生存期和远处无转移生存期较差(补充图3E-H)。以上结果说明，低表达HLF促进NSCLC早期局部复发和多器官远处转移。
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?为了进一步确定 HLF 在 NSCLC 细胞局部肺定植和远处转移中的作用，首先在多个不同亚型的 NSCLC 细胞株中检测了 HLF 的表达。
?如补充图4A和B所示，与非癌永生化肺支气管上皮细胞 BEAS-2B 和正常肺成纤维细胞 WI-38相比，NSCLC 细胞中 HLF 的 mRNA 和蛋白质水平差异下调。我们进一步构建了 HLF 过表达的 NCI-H1975(H1975)和 NCI-H520(H520)肺癌细胞，这些细胞表达所有 NSCLC 细胞系中HLF水平最低，并内源性下调 NCI-H460(H460)和 NCI-H1299(H1299)细胞 HLF 的表达，这两种细胞均表达最高的内源性 HLF 水平(补充图4C和D）。
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?采用小鼠尾静脉模型研究NSCLC细胞的肺定植和生长能力。如图3A-D和补充图4E，上调 HLF 显著抑制 H1975 细胞在肺中的肿瘤发生，表现为肺结节的形成减少，每m㎡的癌细胞数量减少，累积生存率延长。相反，沉默 HLF 对 H460 细胞有相反的效果(图3A-C、E和补充图4E)。
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